红细胞裂解液技术说明与操作指南

1.背景与目的

红细胞裂解液（ACK）通过在受控时间与温度下选择性裂解红细胞、尽量不损伤有核细胞，从而显著降低样本中红细胞负荷并保持细胞活性。实验目的是为了获得红细胞残留低、活率高、表面抗原保留良好的有核细胞悬液，为后续原代培养、流式检测、以及核酸/蛋白提取提供稳定输入质量。

2.作用原理

氯化铵是红细胞裂解液的核心效应成分。其在溶液中与NH₃/NH₄⁺处于平衡：NH₃可跨膜扩散进入红细胞，但NH₄⁺难以外流，并与随之进入的Cl⁻共同使胞内渗透压升高且轻度酸化。红细胞缺乏有效的体积调节能力，水分随渗透梯度内流，细胞迅速吸水膨胀并发生溶血；而有核细胞在短时条件下对该渗透变化更具耐受性，从而实现对红细胞的选择性去除。

3.适用与保存

• 酶消化后组织单细胞悬液的分离与纯化
• 外周血/骨髓/脾来源淋巴细胞的分离与纯化
• 原代培养、细胞融合、流式细胞术上机前的红细胞去除处理
• 蛋白与核酸（DNA、RNA）提取前的样本红细胞清除处理

保存条件：2–8℃避光保存。启封后建议0.22 µm滤膜除菌分装，保持无菌使用环境（洁净台内操作更佳）。

4.配方

配制说明：

将所有试剂溶解于约850 mL去离子水中→将pH调至7.2–7.4→加水定容至1000 mL。

5.使用说明

（1）组织细胞样品（经酶消化的单细胞悬液）

• 制备单细胞：新鲜组织经胰酶/胶原酶消化并分散为单细胞悬液，离心，弃去上清。
• 加入裂解液：取4℃预冷的ACK裂解液，按1:3–5（1 mL细胞压积：3–5 mL裂解液）加入沉淀，轻柔吹打混匀。
• 离心去上清：800–1000 rpm，5–8 min，弃去上层红色清液。
• 洗涤：收集沉淀，加入Hanks’液或无血清培养基，离心清洗2–3次。
• 复裂（可选）：如红细胞去除不充分，重复步骤2–3（建议短时再处理一次，而非显著延长单次时间）。
• 重悬与后续：重悬细胞进入后续实验；若进行RNA提取，建议自步骤4起全程使用DEPC水配制的缓冲/溶液。

注：对表面抗原敏感的样本，可全程在4℃条件下完成红细胞清除处理；必要时采用“短时、多次”的方式提高红细胞去除的充分性。

（2）血细胞（外周血/骨髓/脾来源抗凝血）

• 预处理：使用新鲜抗凝血，先离心去血浆，上清弃去。
• 加入裂解液：取4℃预冷的ACK裂解液，按1:6–10（1 mL细胞压积：6–10 mL裂解液）加入沉淀，轻柔吹打混匀。
• 离心去上清：800–1000 rpm，5–8 min，弃去上层红色清液。
• 洗涤：收集沉淀，加入Hanks’液或无血清培养基，离心清洗2–3次。
• 复裂（可选）：如红细胞去除不充分，重复步骤2–3一次。
• 重悬与后续：重悬细胞进入后续实验；若进行RNA提取，建议自步骤4起使用DEPC水配制的溶液体系。

注：小鼠血通常1–2 min即可完成红细胞清除；人外周血建议4–5 min，上限不超过10 min。

6.关键注意事项与技巧

• 时间控制：限时裂解，优先短时+必要时复裂；首次做1–3/3–5/5–8 min小梯度。
• 温度与混匀：全程4℃预冷有助于降低代谢与应激；混匀要轻柔，避免机械性损伤。
• 洗涤体系：优选无钙镁PBS/Hanks’液或无血清培养基；核酸提取流程中注意DEPC体系一致性。
• 抗凝剂选择：EDTA常用且兼容流式；肝素在部分下游（如PCR）可能引入抑制效应。
• 样本量配比：遵循“细胞压积：裂解液体积”的范围；红细胞负荷高时适当加大体积或延长裂解并监控细胞状态。
• 显微检查：关键节点（第一次裂解后、最后一次清洗后）建议做快速涂片/台盼蓝评估去红效率与细胞活性。
• 污染防控：配制与使用过程保持无菌，启封后分装可降低反复开启带来的污染风险。

7.常见问题（FAQ）

Q1：裂解后仍见红色残留？

A：延长裂解1–2 min或再加一次裂解步骤；同时检查配比是否不足、裂解液是否失效/受污染。

Q2：有核细胞活性下降？

A：可能是裂解过度或离心过猛/过久。缩短裂解时间，降低离心力并缩短时间；全程保持4℃。

Q3：后续流式出现非特异背景高？

A：残留红细胞/游离血红蛋白或未充分洗涤所致。增加1次洗涤，并确保缓冲液不含红细胞残留。

Q4：RNA产量/完整性不佳？

A：自洗涤步骤开始即用DEPC体系；减少常温暴露时间；必要时加入RNA酶抑制剂。

实验安全

• 按照生物安全二级（BSL-2）常规进行操作：手套、护目镜、实验服。
• 含血液/细胞废液按含生物危害化学品规范收集，经实验室规定方式处理或委托处置。
• 溢洒使用0.5–1%次氯酸钠或等效消毒剂及时处置。