细胞核内因子染色流程

一、样本准备

        详见流式细胞术样本制备技术

        1. 收集细胞，200目筛网过滤，收集滤液，300×g离心5 min，弃上清。

        2. 向细胞中加入适量Cell Staining Buffe，用移液枪轻轻吹打细胞重悬。

二、细胞计数

        用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为1 × 107/mL。

三、设置实验分组

        根据实验设计，设置实验分组，每管加入100 μL细胞悬液。

四、封闭Fc受体

        封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

        对于小鼠样本，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5~1 μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10min。

        对于大鼠样本，可使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。

        对于人样本，纯化的CD16单抗可作为封闭FCR封闭剂。加1 μg纯的抗人CD16单克隆抗体，室温孵育10 min。

五、细胞表面抗体孵育

        根据实验设计，除空白对照外，对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL，混匀，4℃避光孵育30 min。

六、固定破膜

        1. 按照说明书稀释固定破膜液

        2. 每管加入1 mL Cell Staining Buffer，300×g离心5 min，弃上清。

        3. 加入100 μL Cell Staining Buffer，重悬细胞。

        4. 每管加入1 mL的1× Fixation Working Solution，轻柔混匀，4℃避光孵育30 min。

       5. 600×g离心5 min，弃上清。

       6. 每管加入2 mL的1×Permeabilization Working Solution，轻柔混匀。

       7. 600×g离心5 min，弃上清。

       8. 重复（6）、（7）步一次。

七、抗体孵育

       1. 加入100 μL 的1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。

       2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5 μL，混匀。

       3. 室温避光孵育30 min。

       4. 加入1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。

       5. 600×g离心5 min，弃上清。

八、上机检测

      1. 加入200 μL Cell Staining Buffer，重悬细胞。

      2. 调整仪器参数，上机检测。

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