原位杂交（ISH）实验方案

        原位杂交（ISH）是一种用于检测和定位细胞或组织中特定核酸序列（DNA或RNA）的实验技术，它利用标记的核酸探针与目标核酸序列进行特异结合，从而观察和分析核酸在细胞或组织天然位置上的表达和分布情况。

        原位杂交的基本原理是利用互补核酸序列间的特异性结合。实验中，将合成的标记探针（通常是RNA或DNA）加到固定的细胞或组织切片上，探针与目标核酸序列杂交形成双链结构。通过后续的洗涤和检测步骤，可以识别和可视化这些杂交信号，以确定目标核酸在样本中的位置和表达水平。

        原位杂交（ISH）实验中，探针标记与检测系统是核酸定位和表达分析的关键，基于地高辛、生物素、荧光标记分子的标记与检测系统是常见的原位杂交检测方法。

        其中地高辛（DIG）标记体系是目前应用最为广泛的标记方法，利用地高辛抗体进行检测。地高辛特异性高，能与探针有效结合，其抗体不与其他生物分子发生交叉反应。此体系的优点是信噪比高、灵敏度高，适用于低拷贝RNA的检测。但地高辛的检测过程相对复杂，通常需要进行免疫分析和底物反应。

        本实验主要介绍利用地高辛（DIG）标记的RNA单链原位杂交技术检测石蜡切片中目的基因的表达情况。

一、样品保存

        冰冻切片的一般样本保存：将其保存在-20℃的100％乙醇中，或将其保存在-20℃或-80℃的塑料盒中，并用保鲜膜覆盖。这种保存方法可以使载玻片保存数年。注意不要将载玻片在室温下干燥保存。

        RNA保存：RNase酶广泛存在于玻璃器皿、试剂以及操作人员的身体和衣物中，因此要注意整个实验过程、手套和溶液的无菌性，防止探针或组织RNA被RNase污染。

二、探针选择

        在原位杂交（ISH）实验中，选择合适的探针对于实验的成功至关重要。探针的选择主要涉及DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针，它们可以通过不同的酶分子反应进行标记，以方便检测特定的核酸序列。

        寡核苷酸探针是一类长度较短的探针，通常可以避免探针内部退火的问题，在杂交过程中具有更好的穿透性。这类探针的优点是它们可以更容易地接近靶标，这是影响原位杂交成功的关键因素之一。较短的寡核苷酸探针长度使它们可以在组织中更快地扩散，从而提高杂交的效率。

         RNA探针由于具有单链结构、较高的分子结合力、耐高温杂交等特点，通常比DNA探针具有更高的检测特异性和灵敏度。RNA探针的长度约为250-1500个碱基，其中800个碱基左右的探针被认为具有最好的灵敏度和特异性。RNA探针的制备涉及转录模板的构建，该模板应支持探针（反义链）和阴性对照（正链）RNA的转录。合成的RNA探针需要验证其对目标片段的灵敏度和特异性，以确保实验结果的准确性。

         DNA探针为原位杂交提供了更高的灵敏度，但是与RNA探针相比，DNA探针与目标mRNA分子的杂交强度较弱，因此杂交后的洗涤过程中应避免使用甲醛，以免破坏DNA-RNA杂交双链。合成DNA探针时需要控制探针片段的长度，通常在300-1000bp左右，这样的长度可以覆盖更长的目标核酸序列片段，从而提高检测的灵敏度。

         探针特异性至关重要。如果知道细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列，则可以在此基础上设计出高度准确的互补探针。如果超过5%的碱基对不互补，探针将只能与目标序列进行较差的杂交。这意味着探针在洗涤和检测步骤中更容易被洗掉，并且可能无法正确检测。

三、实验步骤

1. 样品处理-脱蜡（冷冻切片可跳过此步骤）

         对于甲醛固定的石蜡包埋切片，首先需要进行脱蜡和复水，这一步非常关键，如果石蜡去除不彻底，切片的染色效果就会很差。

         将载玻片放在架子上并进行以下清洗：

         二甲苯洗两次，每次3分钟；二甲苯和100%乙醇1:1配置洗3分钟；100%乙醇洗两次每次3分钟；95%乙醇洗3分钟；70% 乙醇洗3分钟；50%乙醇洗3分钟。

         用冰冷的自来水冲洗，并将载玻片放入自来水中。在后续操作中，切记不要让载玻片干燥，否则会导致非特异性抗体结合和高背景染色。

2. 抗原修复

2.1将含有蛋白酶K的50 mM Tris预热，37 °C孵育，孵育时间一般为10-20分钟，蛋白酶K建议浓度为20µg/ mL。

         在不同实验中，因组织种类、大小、固定时间的差异，最佳酶浓度和孵育时间会有所不同。酶水解不充分会导致杂交信号减弱，而酶水解过度会影响组织形态和杂交信号的位置。建议通过蛋白酶K滴定实验来确定最佳条件。

2.2用蒸馏水清洗载玻片5次。

2.3将载玻片浸入预冷的20%（v/v）乙酸中20 秒。这一步目的是使细胞通透，并允许探针或抗体渗透。

2.4分别用70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇清洗载玻片（每次约1分钟），使其脱水，然后风干。

3. 探针准备

         DNA探针的制备包括DNA片段的初步分离纯化（或cDNA的克隆）和酶促探针标记，以及可选的随机引物标记和缺口平移方法。RNA探针的制备包括转录载体克隆和转录探针标记。寡核苷酸探针的制备需要先获得合成的寡核苷酸片段，然后进行末端标记或尾部探针标记。但无论采用何种标记探针和标记方法，最终都必须评估探针标记效果并准确计算探针浓度。

4. 探针杂交

4.1 根据以下配方制备杂交溶液，并向每张载玻片添加100 μL杂交溶液。

         杂交溶液配方：

盐溶液（20×）

- 4 M NaCl 

- 100 mM EDTA

- 200 mM Tris-HCl pH 7.5

- 100 mM NaH2PO4•2H2O

- 100 mM NaH2PO4•2H2O

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Denhard溶液（50×）

- 5 g聚蔗糖

- 5 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮）

- 5 g牛血清白蛋白（BSA）

- 250 mL无菌dH2O

​

4.2将玻片放入加湿的杂交盒中，在所需的杂交温度下孵育1小时。杂交温度通常在55至62 °C之间。

4.3将探针用杂交液稀释于PCR管中，用PCR仪将RNA或DNA在95℃下加热2分钟，使其变性，然后立即将探针放在冰上冷却，以防止重新退火。

4.4 吸去杂交液，加入50-100 μL探针稀释液覆盖整个样品。在加湿杂交室中 65°C孵育过夜。用盖玻片盖住样品以防止蒸发。

        在此步骤中，RNA探针将与相应的mRNA杂交，或者DNA探针将与相应的细胞DNA杂交。探针的最佳杂交温度取决于目标序列中碱基的百分比，其中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。

5. 清洗

        可以通过调节溶液参数（例如温度、盐浓度和去垢剂浓度）来消除非特异性相互作用。

5.1制备1 L 20 ×柠檬酸钠缓冲液（SSC）

        调节pH至5，定容至1L，高压灭菌。

5.2用含50％甲酰胺的2 × SSC在37-45℃下洗涤三次，每次5分钟。

5.3 0.1 - 2 × SSC在25-75°C下清洗三次，每次5分钟。此步骤将消除非特异性和/或重复性DNA/RNA杂交。

        优化严格清洗的温度和盐浓度如下：

        对于非常短的DNA/RNA 探针（0.5 - 3 kb）或非常复杂的探针，洗涤温度应该较低（最高45°C），严格性更低（1 - 2 × SSC）。

        对于单个基因座或更大的探针，温度应在65°C左右，且严格性应较高（小于0.5 × SSC）。

        对于重复探测，应将温度设置为最高设置，并将严格度设置为最高设置。

5.4室温下用MABT（含Tween 20的马来酸缓冲液）洗涤两次，每次30分钟。MABT比PBS更温和，更适合核酸检测。

        加入三羟甲基氨基甲烷，调节pH值至7.5。大约需要100克三羟甲基氨基甲烷。补足至1升。

5.5干燥载玻片。

6. 封闭和抗体孵育

6.1移至加湿箱中，每片加入200 µL封闭缓冲液（MABT + 2% BSA、牛奶或血清）。室温下封闭1 - 2小时。

6.2将抗标记抗体按所需稀释度加入封闭缓冲液中，室温下孵育1 - 2小时。

6.3室温下用MABT清洗载玻片5次，每次10分钟。

6.4室温下，用预染色缓冲液（100 mM Tris pH 9.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl2）清洗载玻片两次，每次10分钟。

6.5如果需要荧光检测，则跳至下一步。对于其他形式的检测，将载玻片放回加湿室并根据制造商的说明显色。

6.6用蒸馏水清洗载玻片。

6.7让载玻片风干30分钟。然后用100%乙醇清洗并彻底风干。

6.8使用DePeX封片液将载玻片封好后即可进行测试。

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