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流式实验样品制备实验指南
流式实验，即流式细胞术（Flow Cytometry），是非常重要的一种生物分析技术，常用于细胞免疫表型分析、细胞分型、细胞功能评估等实验场景。流式实验主要包括前期实验设计、样品制备、样品染色和样品分析四个步骤，而其中样品制备是流式实验非常重要的步骤之一，影响了实验结果的准确性。
图1 流式细胞术主要实验流程
单细胞悬液是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。制备过程中，它既要求组织分散成为单个细胞，又要维持细胞的固有属性及生物学特性。外周血细胞或悬浮生长的细胞最适合流式分析，其他样本类型在制备过程中可用的方案较多，本文总结了4种流式样品制备成单细胞样品的实验步骤，以作参考。
一、外周全血
流式实验中常采用EDTA或肝素钠抗凝的外周全血。处理方法：
1、用溶血素裂解红细胞；
2、用Ficoll或Percoll从外周全血中分离PBMCs，从对应密度层获得目的细胞进行清洗和染色。
表2：裂红和淋巴细胞分离液方法对比
1、外周全血裂红实验方案
1.1裂红洗涤方案
1）将适量的表面抗体加至抗凝全血中，室温孵育15分钟；
2）加入1×红细胞裂解液（例如，R478427），室温避光孵育10分钟，300-400 xg离心5分钟，弃上清；
3）加入PBS/流式细胞染色缓冲液（例如，T494526），混匀；
4）按上述条件再次离心并将沉淀分散在PBS/流式细胞染色缓冲液中；
5）3小时内上机检测。若不能立刻上机，用500 ul 4%多聚甲醛（例如，P395744）重悬细胞，4℃避光保存，24 h内上机分析。
1.2裂红洗涤方案
1）将适量的表面抗体加至抗凝全血中，室温孵育15分钟；
2）加入1×红细胞裂解液，室温避光孵育10分钟；
3）混匀，上机检测。
2、外周血单个核细胞分离
1）用无菌稀释液将血样稀释2-4倍；
2）在50 mL锥底离心管中先加入15-20 mL分离液，然后缓慢加入20-30 mL经稀释的全血或组织细胞悬液至分离液液面之上；
3）室温400 xg离心15-30分钟，保证转子速度平稳下降；
4）将离心管小心地从离心机中取出，缓缓地吸去最上层，避免接触单个核细胞层；
5）将单个核细胞层缓慢转移到另一只50 mL锥底离心管中；
6）加入无菌洗涤液并混匀后，室温300 xg离心10分钟，小心弃掉上清；
7）为去除残余血小板，可将细胞重悬于30-50 mL无菌洗涤液中，室温200 xg离心10-15分钟，弃上清；
8）可选择性重复步骤7，以去除绝大部分血小板；
9）用缓冲液或培养基重悬细胞，进行检测、培养等后续操作。
注：骨髓样本的实验步骤同外周全血。
3、外周血中血小板富集的血浆制备
1）取适量体积血液于25℃下300 xg离心10分钟；
2）将离心后获得的血浆层，于25℃ 1600 xg离心10分钟；
3）弃上清，沉淀重悬于Tyrode’s缓冲液或含EDTA的缓冲液中，进行下游实验。
二、培养细胞
1、收集处于对数生长期的细胞。
2、PBS清洗细胞（例如，T494526）。
3、加入胰蛋白酶（例如，T105532）或Accutase消化液解离细胞，筛网过滤。
4、1500 rpm离心10分钟，弃上清。
5、用PBS缓冲液（例如，T494526）重悬细胞沉淀，收集细胞悬液，进行细胞计数和活力检测。随后可按照荧光抗体染色的操作，进行后续实验。
三、组织
1、淋巴组织
1）将脾、胸腺或淋巴结采集到含缓冲液或培养基的细胞培养皿中，用注射器活塞在细胞筛网上研磨；
2）使用PBS（例如，T494526）冲洗细胞滤网，滤掉细胞团块和碎片；
3）4˚C 300-400 xg离心5分钟，弃上清；
4）用适当体积的缓冲液重悬细胞，进行细胞计数和活性检测，并调整细胞浓度至107个/mL，进行下游实验。
2、非淋巴组织
1）使用手术剪或解剖刀片将组织切成2-4 mm小块，用合适类型的消化酶，孵育；
2）过细胞筛网，将细胞悬液收集在离心管内；
3）4˚C 300-400 xg离心，5 分钟，弃上清，用PBS重悬细胞（例如，T494526）；
4）重复离心，并用流式细胞染色缓冲液重悬细胞，进行细胞计数和活性检测，调整终浓度达到10⁷个/mL。
以酶解法处理实体瘤组织为例：
1、实体瘤单细胞悬液制备。
实体瘤的酶解利用胰蛋白酶破坏细胞间粘附和II型胶原酶消化基质成分，并且DNA酶I（例如，D128591）的加入可以确保倍性仅从完整的细胞群体中确定。酶解法可以单独使用或与机械方法结合使用，建议用于鳞状肿瘤的完全分解。
1）酶混合物制备：将2.5 mg/mL胰蛋白酶（例如，T105532）、0.5 mg/mL II型胶原酶、20 µg/ml DNase I（例如，D128591）添加至离心管中混合，37°C孵育15 分钟；
2）将新鲜的肿瘤组织或机械分解的组织放入酶混合物中，37°C温和搅拌1h；
3）过80 µm金属网筛，加入2ml灭活的FBS终止反应，室温250 xg离心10分钟，弃掉上清；
4）用培养基重悬细胞，并进行细胞计数和活性检测。
2、乙醇固定：
对于已获得的实体瘤单细胞悬液，可以使用乙醇固定以延长保存天数，且不影响核完整性。
1）将2 mL重悬单细胞悬液涡旋，期间滴式加入6 mL冰70%乙醇。
2）加盖置于4°C保存，可保存30 mins-5 days。
3）固定后的细胞可用于部分流式实验。
四、生物液体样本
如肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液
1、收集液体样本，300-400 xg离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀；
2、如细胞沉淀中肉眼可见红细胞，加入适量红细胞裂解液（例如，R478427），根据样本红细胞含量避光孵育2-10分钟，300-400 xg离心5分钟，弃上清，收集细胞沉淀；PBS（例如，T494526）重悬细胞，300-400 xg离心5分钟，弃上清（选做）；
3、PBS（例如，T494526）重悬细胞，300-400 xg离心5 分钟，弃上清；
4、将细胞重悬于适当体积的PBS（例如，T494526）或流式细胞染色缓冲液中，进行细胞计数和活性检测，并将终浓度调整为1x107个细胞/ml，进行下游实验。
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