| 货号 (SKU) | 包装规格 | 是否现货 | 价格 | 数量 |
|---|---|---|---|---|
| B744270-200U |
200U |
期货  |
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| B744270-1000U |
1000U |
期货 |
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| 别名 | Bsu DNA 聚合酶，大片段 |
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| 规格或纯度 | EnzymoPure™, 不含DNA内切酶和外切酶，不含核糖核酸酶。 |
| 稳定性与储存 | -20℃保存。 |
| 英文名称 | Bsu DNA Polymerase, Large Fragment |
| 储存温度 | -20°C储存 |
| 运输条件 | 超低温冰袋运输 |
| 产品介绍 |
阿拉丁生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, Bsu', ") DNA聚合酶大片段，具有5'→3' DNA聚合酶活性，不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。"Bsu DNA聚合酶大片段具有链置换 活性，常用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)，其等温扩增(isothermal amplification)的温度通常为37℃。Bsu'DNA Polymerase, Large Fragment是将枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'核酸外切酶结构域(1-296 aa)删除后表达剩余蛋白序列而获得的。该酶保留了枯草芽孢杆菌DNA 聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但是缺失了5'→3'核酸外切酶和3'→5'核酸外切酶活性。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)主要包括以下几个组分：重组酶(recombinase) T4 UvsX，重组酶载入因子(recombinase loading factor) T4 UvsY，Bsu DNA聚合酶大片段以及单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein)T4 gp32。在ATP存在的情况下，UvsX与引物相结合，扫描DNA模板，寻找到与引物配对的核酸序列，一旦引物被定位到了DNA模板的同源序列，ATP水解产生ADP，ADP与UvsX的结合导致UvsX被gp32取代而从DNA模板上解离下来，gp32作为单链结合蛋白可以稳定被置换的DNA链的结构，Bsu DNA聚合酶大片段因引物与DNA模板的配对而进行引物的延伸和模板的扩增。重组酶载入因子T4 UvsY和拥挤试剂(crowding reagent) Carbowax20M的加入有利于UvsX与引物的结合，即有利于重组酶UvsX的载入。阿拉丁生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果请参考图1。图1.阿拉丁生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果图。使用本产品或竞争(Competitor) N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment，在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment，37℃孵育15min进行反应。反应完毕后冰浴3-5min，75℃孵育20min以终止反应。取出5μl反应液，加入1μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60min)；之后用Gel-Red 室温染色15min，然后进行拍照记录。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μl)：10mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃), 50mM NaCl, 10mM MgCl2', ", 1mM DTT, 125µM dNTP Mix, 0.5µM Template/Primer (Template: 5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3 / Primer: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')；Primer和Template按照"D0251产品说明书中推荐的程序进行退火反应，之后以Primer/Template退火产物为底物，进行DNA模板的延伸。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。 用途： RPA法等温扩增；RPA链置换的DNA合成；随机引物法标记；cDNA第二条链合成；单个dA的加尾。来源： 大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I基因(297-880 aa)获得的重组蛋白。酶储存溶液： 25 mM Tris-HCl (pH7.4), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol.10XReaction Buffer: 100 mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃), 500 mM NaCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT.失活或抑制： 75℃孵育20min。注意事项： 由于缺乏3'→5'核酸外切酶活性，", 'Bsu', " DNA Polymerase, Large Fragment不能切除3'未配对的突出末端，因而不适用于产生平末端。"Bsu', " DNA Polymerase, Large Fragment 25℃时仍保留50%的DNA聚合酶活性，是相同温度下Klenow片段(3'→5' exo-)活力的两倍。"本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明： 1.Primer/Template杂合双链的退火。将单链Primer和DNA Template等摩尔数混合，推荐的终浓度为10µM，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成Primer/Template杂交双链。推荐使用阿拉丁生产的D0251 Annealing Buffer for DNA Oligos (5X)，并按照该产品使用说明进行退火反应。退火后的双链可以直接用于后续实验，或在-20℃保存备用。2.对于DNA模板链的延伸，参考下表在冰浴中配制反应体系。 Reagent Volume Final Concentration Nuclease-Free Water 15µl - AnnealedPrimer/template (10µM each) 1µl 0.5µMeach Bsu Reaction Buffer(10X) 2µl 1X dNTPMix (2.5mM each) 1µl 125µM BsuDNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) 1µl 0.25U/µl Total Volume 20µl - 注：如果同时进行多个反应，可把上表中除Annealed Primer/template之外的所有组分预先混合，然后再分装到各反应管。3.反应条件：37℃孵育适当时间。参考图1，其中的孵育时间为15min。该酶延伸速率预计和常规DNA聚合酶类似，大约1000bp/分钟。具体使用时需要适当摸索孵育时间，以确定比较合适的延伸时间。4.终止反应：75℃孵育20min以终止反应。One unit is defined as the amount of enzyme that incorporates 10nmol dNTPs into acid insoluble material in 30 minutes at 37℃. Source： Recombinant Bacillus subtilis DNA polymerase I fragment (297-880 aa) expressed in E. coli.Enzyme storage buffer： 25mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) glycerol.Inactivation or inhibition： This enzyme is inactivated by incubation at 75℃ for 20min.Precautions： Due to the lack of 3'→5' exonuclease activity, Bsu DNA Polymerase, Large Fragment cannot remove 3' overhangs and is therefore not suitable for generating blunt ends.Bsu DNA Polymerase, Large Fragment still retains 50% DNA polymerase activity at 25℃, which is twice the activity of Klenow fragment (3'→5' exo-) at the same temperature.This product is for R&D only. Not for drug, household, or other uses.For your safety and health, please wear a lab coat and disposable gloves during the operation.Instructions for Use： 1. Annealing of Primer/Template hybridsMix equimolar of single-stranded Primer and DNA template to a recommended final concentration of 10µM each, incubate at 90℃ for 1min, and then anneal by gradient cooling to 25℃ to form Primer/Template hybrids. We recommend using 's Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) for the annealing according to the instructions of the product. The annealed duplex can be used directly for subsequent experiments, or stored at -20℃ for future use.2. Set up the following reaction on ice.ComponentVolumeFinal ConcentrationNuclease-free Water15µl-Annealed Primer/Template (10µM each)1µl0.5µM eachBsu Reaction Buffer (10X)2µl1XdNTP Mix (2.5mM each)1µl125µMBsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl)1µl0.25U/µlTotal Volume20µl-Note: When multiple reactions are required, prepare a master mix including all reagents except the Annealed Primer/template and then dispense to different nuclease-free PCR tubes. Finally, add Annealed Primer/Template hybrids to each tube.3. Incubate at 37℃ for an appropriate time period. The extension rate of this product is expected to be similar to that of conventional DNA polymerases, which is about 1000bp/min. For specific use, it is necessary to optimize the incubation time.4. Incubate at 75℃ for 20min to stop the reaction. |
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